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Alpha SureFire 细胞激酶和细胞信号蛋白检测技术 -打开宽广的激酶探索道路

      Alpha SureFire 技术能够快速灵敏地对细胞水平的蛋白质磷酸化作用进行定量检测。它基于成熟可靠的 Alpha 技术,将 Alpha 供体微珠和受体微珠结合在一起,经过一系列化学反应,使细胞内源性蛋白磷酸化信号增强而被检测到。配合细胞转染技术,可以完成高敏感度的各种信号通路、受 体及目标激酶的检测。SureFire 技术可以完成细胞培养及分析物检测“一体化”模式。此方法简化了耗时的分离及洗涤步骤。

SureFire /SureFire Ultra
      在传统的AlphaScreen Surefire 检测方法中,用于调控细胞的抗体会与Protein A竞争结合,从而抑制AlphaScreenSurefire(图1) 的信号。新的AlphaLISA Surefire Ultra (图2)采用成熟的CaptSure™技术代替Protein A,不仅实现了试剂盒抗体捕获的特异性,而且具有更低的检测背景。而且新的试剂盒利用AlphaLISA受体微珠代替AlphaScreen受体微珠,对血红蛋白淬灭干扰具有更加出色的抗干扰光谱特性。

图1 AlphaScreen Surefire
图2 AlphaLISA Surefire Ultra

检测特点:
• 细胞样本经过刺激、裂解后只需混合 ,即可检测,无需洗涤 
• 检测灵敏度大于等于Western Blot 方法;可以检测过表达及内源水平表达的蛋白;兼容稳定表达细胞系或原代细胞及干细胞 
• 无论96、384或1536孔板的检测模式,均可得到很高的Z’值
• 适用于抗体药物的开发使用,适应组织裂解液样品(Surefire Ultra):

      Surefire Ultra 方法使用新的Captsure标签,有效的避免样品中的干扰抗体与Protein A的非特异性结合(图3)。 而且, 与传统的Surefire检测相比,Surefire Ultra也更加适合应用于肝脏这类器官、组织样品的检测。

图3由Protein A与抗体药物直接结合而产生信号抑制(假阳性)示意图


检测步骤 

刺激细胞, 加入lysis buffer
裂解细胞
将细胞裂解液与抗体及受体微珠混合,
室温孵育1~2小时
加入供体微珠, 
室温孵育1~2小时
检测



Surefire 与 Surefire Ultra 检测结果对比

Surefire Ultra与HTRF (Company C) 检测结果对比


重组磷酸化
 ERK的测定。x轴的浓度值与所测样品浓度有关
(对SureFire 而言是 10 μL样品,对 HTRF而言是16μ样品) 

AlphaLISA SureFire Ultra 检测法 (LLOD 0.07 ng/mL) 的灵敏度明显优于标准型与增强型 Company C试剂盒(两种Company C试剂盒的LLOD均为0.63 ng/mL)。 另外,AlphaLISA SureFire Ultra p-ERK 试剂盒的信号窗口分别比高级和标准Company C HTRF p-ERK试剂盒大50 - 100 倍,即前者具有更宽的动态范围。


IgG混合后检测结果对比:

EGF刺激A431细胞后,在裂解液中加入 rabbit IgG (10μg/mL),分别用SurefireSurefire Ultra磷酸化ERK(T202/204)检测试剂盒检测梯度稀释的细胞裂解液,Surefire试剂盒的检测信号在IgG抗体的影响下有所降低,但是 IgG抗体的加入对Surefire Ultra的检测信号不产生任何影响。

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